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食品源金黄色葡萄球菌耐药基因的检测
2017.08.29

食品源金黄色葡萄球菌耐药基因的检测

作者:余璐

来源:现代食品·上      2017年6期

    金黄色葡萄球菌是目前造成食品安全隐患的主要细菌之一[1]。它是一种在自然界常见细菌,水、空气、沙尘以及人和动物的排泄物中均可找到。因此,食品受其污染的机会很多。大部分的金黄葡萄球菌能产生肠毒素,所以一旦细菌污染食品,且在合适的温度环境下,细菌可以大量繁殖并产生肠毒素,引起消费者食物中毒。由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒,在世界各国都极为普遍。据报告,由金黄色葡萄球菌引起的感染在北美及欧洲地区占第二位,仅次于大肠杆菌。随着大量广谱抗菌药物在医学临床的广泛使用,金黄色葡萄球菌的耐药性不断增强。若免疫系统出现弱点时,即使没有伤口也可以导致抗药性金黄色葡萄球菌感染。金黄色葡萄球菌耐药机制极为复杂,特别是随着抗菌药物的不断研发和广泛使用,不断有新型耐药分子机制出现。目前分析研究金黄色葡萄球菌耐药机制,是国内外相关研究的重点方向之一。而对金黄色葡萄球菌中耐药基因的检测,是研究金黄色葡萄球菌耐药机制的一项重要基础。本实验主要采用PCR法对食品中分离得到的103株金黄色葡萄球菌进行甲氧西林类基因、氯霉素类基因、红霉素类基因、四环素类基因、喹诺酮类基因和内酰胺酶类基因检测。
  1 研究现状
  1.1 实验目标菌种的简介
  金黄色葡萄球菌为革兰阳性菌。典型的金黄色葡萄球菌为球形,直径0.8 μm左右。无芽孢,无鞭毛,不能运动,呈葡萄状排列。金黄色葡萄球菌营养要求不高,在普通培养基上生长良好,需氧或兼性厌氧,最适生长温度37 ℃,最适pH7.4,干燥环境下可存活数周[2-3] 。
  金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染的重要病原菌,毒性强,可引起疖肿、局部毛囊炎、蜂窝织炎,还可以引起肺炎、心包炎、骨髓炎、肾盂肾炎和肾脓肿等多种系统的化脓性疾患以及菌血症、心内膜炎等危及生命的疾病[4]。
  金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力,对青霉素和红霉素等高度敏感,对碱性染料敏感,可极低浓度的的龙胆紫液一直生长。对磺胺类药物敏感性低。
  食品中肉类、禽类、蛋类、水产类和乳制品类等都容易感染金黄色葡萄球菌。
  1.2 金黄色葡萄球菌流行病学及致病性
  金黄色葡萄球菌的引发的疾病多见于春秋季,中毒食品以奶、肉、蛋、鱼及其制品为主。
  一般说,金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品:食品加工人员、炊事员或销售人员带菌,造成食品污染;食品在加工前本身带菌,或在加工过程中受到了污染,产生肠毒素,引起食品中毒;熟食制品包装不密封,运输过程受到污染;奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时,也对肉体其他部位的产生污染。
  金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶和其他结构成分[5-6] ,如:溶血毒素、肠毒素、表皮剥落毒素和杀白细胞素等。其中肠毒素是引起食物中毒的主要原因。
  1.3 金黄色葡萄球菌耐药研究现状
  抗生素对细菌的抑制作用主要通过抑制蛋白质的合成,核酸的合成,细胞壁的合成三种途径实现。相应的微生物也产生了三种耐药机制:修改药物的结构,药物外排和改变药物靶位点。
  最初,金黄色葡萄球菌对青霉素的敏感度在90%以上,从而大部分抗生素在临床上对金黄色葡萄球菌所引起的病症起到了很好的治疗作用[7]。但4年后英国便发现了金黄色葡萄球菌青霉素耐药株,此耐药菌能产生质粒介导的青霉素酶,可破坏青霉素的β-内酰胺环,使青霉素是去抗菌能力。至20世纪50年代,近半数的金黄色葡萄球菌对青霉素产生耐药性[8]。并且紧跟着发现了其他耐抗生素的金黄色葡萄球菌,如四环素和红霉素等。在医院,耐甲氧西林和其他抗生素的金黄色葡萄球菌广泛流行,对万古霉素不敏感的菌株也有所增加,给临床治疗带来很大困难。金黄色葡萄球菌除了引起感染,其产生的肠毒素可污染食物导致食物中毒,为人类带来非常严重的公共卫生负担。

   金黄色葡萄球菌耐药机制极为复杂,特别在抗菌药物选择压力下,新型耐药分子机制不断出现。同一耐药表型可能由同一耐药基因引起,也可能由不同的耐药基因引起,甚至是不同耐药基因共同作用的结果。目前,临床常用的传统耐药表型检测耗时费力,而且由于金黄色葡萄球菌对某些抗菌药物表现为异质性,因此,耐药基因检测比耐药表型检测更加准确。从分子水平分析金黄色葡萄球菌耐药基因以阐明其耐药机制,是目前国内外相关研究的重点方向之一。
  耐药基因的常规分子检测方法包括了普通PCR、荧光PCR和LAMP等。LAMP技术是发展较早的恒温扩增技术,兴起于本世纪初,在以其检测灵敏、肉眼直接观察结果的便捷特点,深受广大检测人员青睐,但同时由于其对环境场地清洁度、人员操作水平要求严苛,导致了其推广受限。普通PCR和荧光PCR检测方法有特异性强、灵敏度高等优势,但需要价格较贵的PCR仪,检测成本较高。
  1.4 检测方法
  PCR分析:PCR即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),其原理是双链DNA在高温时发生变性解链变成单链,温度降低至退火温度后,引物与DNA模板结合,在DNA聚合酶作用下,在延伸温度下根据碱基互补配对原则以dNTP为反应原料,靶序列为模板,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,并复性成为双链,如此经过几十个循环,目的片段便以2为底数的指数增长,进而扩增出目标DNA序列,PCR是一种体外扩增特定DNA的高效准确的方法。
  2 材料与设备
  2.1 试验菌株
  来自市场上各种食品分离得到的金黄色葡萄球菌103株(已提取DNA,并鉴定)。
  2.2 试剂
  2000bp DNA Ladder Marker(大连宝生物工程有限公司);6×loading buffer(大连宝生物工程有限公司);PCR扩增试剂(大连宝生物工程有限公司);琼脂糖(Agarose G-10)(Biowest 香港)。
  2.3 仪器设备
  TSNENEN031445PCR仪(BIO-RAD);DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂);Gel Doc XR S.N76S/03894凝胶成像仪|(BIO-RAD 美国);G8023ESL-V8微波炉(GALANZ);PL303电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);BCD-235F冰箱(伊莱克斯;AKHL-Ⅲ-24型艾科(台湾)超纯水系统(成都康宁实验专用纯水设备厂);YN100P制冰机(因纽特);proline移液器1套(0.5~10 μL、2~20 μL、20~200 μL、
  100~1 000 μL)(百得实验室仪器有限公司);枪头
  (1 mL、200 μL、20μL);离心管(1ml 、200 μL)。
  2.4 引物
  甲氧西林类基因(mecA);氯霉素类基因(chlA);红霉素类基因(erm);四环素类基因(tetA);喹诺酮类基因(norA);内酰胺酶类基因(blaZ)。
  3 实验方法
  3.1 PCR引物设计
  引物根据Genbank数据库所收录序列,采用Primer Premier5.0软件设计而成。由生工生物工程(上海)有限公司提供(见表1)。
  3.3 凝胶电泳检测
  ①配制1%的琼脂糖电泳胶(TAE)30 mL、60 mL,导入模板凝固定型。②分别取5 μLPCR样液与1 μl6×
  loading buffer混匀。③将样液及2000bp DNA Ladder Marker加入电泳胶的点样孔。④打开电泳仪电源,正确连接正负极,在U=185 V、I=80 mA条件下电泳45 min。⑤电泳结束后,打开凝胶成像仪电源开关及QuantityOne Basic程序。⑥将电泳胶推入凝胶成像仪中,打开紫外灯。⑦显影后,照胶并保存图片。
  4 结果与分析
  从食品中分离的103株金黄色葡萄球菌菌株中耐药基因检出率分别为mec69.9%、chl80.6%、erm95.1%、tet87.4%、nor84.5% 、bla18.4%。97.03%的菌株携带两种或两种以上耐药基因。其中,同时携带6种基因的有8株,携带5种基因的有45株,携带4种基因的有32株,携带3种基因的有8株,携带2种基因的有5株,只携带一种基因的2株,仅有1株不携带以上六种基因。
  部分PCR扩增结果如图1~6。
  实验结果显示,103株食品源金黄色葡萄球菌中,甲氧西林基因、氯霉素基因、红霉素基因、四环素基因和喹诺酮类基因的检出率都较高,内酰胺酶类检出率相对较低。且绝大多数菌株都携带1种以上耐药基因。结果显示多数菌株可能具有多重耐药性。这些基因的存在,可能会使菌株产生耐药性。金黄色葡萄球菌具有高耐药性,严重影响食品安全性。更会严重影响临床医学上对相关病症的治疗。
  5 结论
  如今,金黄色葡萄球菌的耐药性十分严重,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是我们目前面临的最为严重的耐药菌之一。金黄色葡萄球菌不但具有内在耐药性,而且可以通过获得其他耐藥基因而呈现出多重耐药性。目前其耐药机制尚未能完全阐明。就耐甲氧西林金黄色葡萄球菌举例,研究认为,其耐药最主要原因是染色体中含有mecA基因,但研究还发现,携带mecA的金黄色葡萄球菌并非全部表现出对
  β-内酰胺类抗生素耐药,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也并不一定全部携带mecA。
  本实验对103株食品源金黄色葡萄球菌中6种耐药基因的检测,有助于今后再对其进行耐药性分析和抗生素耐药表型研究,并比对耐药基因的检测结果与表型耐药性检测结果是否一致,以确定上述基因是否是金黄色葡萄球菌耐药的主要原因。并对今后了解研究金黄色葡萄球菌的耐药机制具有实际意义。
  参考文献:
  [1]朱德妹,张婴元,汪 复.2007年上海地区细菌耐药性监测[C].全国细菌耐药监测与临床专题学术会
  议,2008.
  [2]唐俊妮,龙 飞,史贤明,等.金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法的比较研究[J].中国卫生检验杂志, 2008,18(8):1467-1469.
  [3]朱乐敏.食品微生物[M].北京:化学工业出版
  社,2006.
  [4]李仲兴,郑家齐,李家宏.诊断细菌学[M].香港:黄河文化出版社香港,1992.
  [5]姜延龙,张 宇,田 波,等. PCR技术检测金黄色葡萄球菌进展[J].食品科学,2006,27(5):265-269.
  [6]索玉娟.食品中金黄色葡萄球菌的分布及其肠毒素基因的研究[D]. 保定:河北农业大学,2008.
  [7]焦瑞身.今日的微生物学[M].上海:复旦大学出版
  社,1989.
  [8]Wallmark G. The Production of Penicillinase in Staphylococcus aureus pyoyenes and its Relation to Penicillin Resistance.[J]. Acta Pathologica Et Microbiologica Scandinavica,1954,34(2):182.
  基金项目:国家自然基金项目“食品源金黄色葡萄球菌不同分离菌株生物被膜形成与吸附素基因网络关系的研究”(编号:31071515)。
  作者简介:余 璐(1989—),女,助理工程师;专业方向为食品质量与安全