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新脑膜炎球菌结合疫苗技术发展进展
2018.03.22

本文转载自微信公众号:生物制品圈

原文链接:http://mp.weixin.qq.com/s/cYqUhU0tYHv1hpnGPWds7g


背景:在撒哈拉沙漠以南的非洲地区,A型脑膜炎双球菌是造成细菌性脑膜炎的主要原因。脑膜炎球菌是一种胞外多糖包被的病菌。针对该多糖产生的抗体可以起到的保护作用。纯化多糖疫苗对控制A型脑膜炎球菌引起的流行病仅具有较小成功率。而蛋白-多糖结合疫苗对多种价态的病菌具有高效保护作用。
方法:单价A型脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗已被脑膜炎疫苗项目(PATH和世界卫生组织的合作关系)的科学家发明出来。
结果:生物制品评价与研究中心的细菌多糖实验室发明了一种高效结合方法。印度血清研究所进一步发展该方法,利用纯化的A型多糖和载体蛋白破伤风类毒素生产现在应用的高效A型多糖结合疫苗。
结论:虽然多年来,脑膜炎球菌多糖疫苗在非洲脑膜炎球菌带预防脑膜炎球菌流行病作用有限。但我们合作开发的A型结合疫苗是一种安全高效的疫苗。


脑膜炎球菌是流行性病原,是造成成人、儿童细菌性脑膜炎的重要原因。关于脑膜炎球菌疾病对公共卫生的威胁程度随着时间及区域变化会发生较大变化。但每当脑膜炎球菌疾病发生时,脑膜炎球菌的流行病潜力涉及特殊的公共卫生安全。

脑膜炎球菌基于化学成份及不同的胞外多糖被分为12种不同价态。几乎所有的脑膜炎球菌疾病都是由A、B、C、X、Y和W型脑膜炎球菌造成的。不同价态的影响重要性随地理区域发生变化。A型脑膜炎球菌在撒哈拉沙漠以南的非洲是最重要的脑膜炎疾病的因素,而在美国,一半的脑膜炎球菌疾病是由C、Y型引起的。在亚洲国家,80%的疾病由B型脑膜炎球菌引起。X型和W型在非洲造成较小或中等规模疾病爆发。

人类是脑膜炎球菌唯一的自然宿主。5%-10%的成人是无症状脑膜炎球菌携带者。在引进A型结合疫苗前,数据显示撒哈拉沙漠以南非洲A型脑膜炎球菌携带率小于1%。

A型脑膜炎球菌结合疫苗的必要性

许多的非洲流行疾病与A型脑膜炎球菌有关。在过去的20年里,蒙古、尼泊尔、印度均报道过A型流行病爆发,但相较于撒哈拉沙漠以南的非洲程度较小。非洲“脑膜炎带”面积巨大,从西部的塞内加尔延伸到东部的埃塞俄比亚,有约4.5亿人。非洲“脑膜炎带”的概念是由Lapeyssonnie在1963年第一次提出。脑膜炎球菌流行病易发于炎热、干燥、多灰的季节,一般是一月到五月,而雨季后立即停止。每年都会在多个国家集中发生流行病,而每8-12年会发生流行病大爆发。流行病的周期性反映了随时间人口免疫性的巨大变化。

在非洲主要流行病中,100-800人/每100000人(部分地区高达1%)是由A型脑膜炎球菌引起的。尽管投入了百万剂量的A/C多糖疫苗来应对流行病爆发,但还是存在高比例的爆发。A型脑膜炎球菌流行病爆发经常持续2个月以下,而相应措施需要菌种鉴定、寻找疫苗、获得资金用于疫苗购买和运营费用。以上过程都需要时间,相应措施经常滞后甚至在流行病爆发结束后。

在1996年-1997年,西非遭遇了有史以来最大的脑膜炎流行病爆发,18万感染案例,2万人死亡。从1998年到2010年,WHO报道有70万新增急性脑膜炎病例[8]。其中受影响最严重的国家包括布基纳法索、尼日利亚、乍得、埃塞尔比亚。在2002年,爆发于以上国家的案例占整个非洲案例的65%。在2009年,尼日利亚报道7万A型脑膜炎感染案例。在2004年,不属于脑膜炎球菌带的刚果民主共和国报道了1.1万急性脑膜炎案例,脑膜炎带似乎正在扩大。

脑膜炎球菌多糖和结合疫苗

脑膜炎多糖疫苗类似于其他细菌多糖疫苗,不能有效地刺激幼儿的免疫系统,对婴儿无免疫原性。唯一例外的是A型脑膜炎球菌多糖因不太了解的原因在初次免疫时,6月龄的婴儿产生免疫性。而在两剂免疫计划下,婴幼儿可产生有效免疫。尽管如此,在使用了数以百万剂量的A型脑膜炎球菌多糖疫苗后,在非洲A型脑膜炎流行病还在持续爆发。

发展和使用脑膜炎球菌多糖结合疫苗已经被论述过,本文主要聚焦于A型脑膜炎球菌多糖结合疫苗。

在商品化生产b型流感嗜血杆菌结合疫苗前,40年前,Beuvery和Jennings 、Lugowski等人进行了最初关于A型脑膜炎球菌结合疫苗生产与优化的研究。他们描述了两种结合A型多糖和蛋白的方法。第一种方法利用高碘酸盐氧化部分解聚了的多糖的醛基端。活化后的醛基段通过还原胺化反应与存在于氰基硼氢化钠环境下的载体蛋白的自由氨基段结合,大多数结合与赖氨酸处。该方法活性位点存在于多糖的特殊位点。第二种方法利用碳二亚胺共价连接高分子量的多糖羧酸基团和载体蛋白的赖氨酸。使用第二种方法时,活化结合位点比较随机。从生化角度来讲,特异性的活化结合位点相较于随机的活化位点,对多糖抗原表位损害较小,因此更具吸引力。

Beuvery 等人制备了A型结合疫苗免疫小鼠。使用六碳间隔的方法比在pH11时使用溴化氰在多糖上结合氰酸酯基团的方法更具免疫原性。 好像高pH值会导致A型多糖o-乙酰基的丢失。研究显示o-乙酰基对于A型多糖的免疫原性至关重要[15]。 A型结合疫苗可以刺激T细胞依赖免疫,随后单独的多糖免疫起到增强的作用。Beuvery 研究显示C型多糖结合疫苗中的游离多糖需要减少(约10%),但不需要消除。

A型单价多糖结合疫苗在非洲发展应用是因为:(1)流行病学显示在撒哈拉沙漠以南,A型单价多糖结合疫苗可以预防90%当地疾病和流行性脑膜炎球菌疾病。(2)相较于多价产品更廉价。

因多糖结合疫苗免疫反应更持久,因此婴儿对其免疫反应更好。几种脑膜炎球菌多糖结合疫苗制备方式在相关文献中被介绍。目前获得许可的多糖结合疫苗含有蛋白通过氨基酸共价结合修饰或活化后的多糖形成的蛋白-多糖杂交组合。蛋白部分可提供了T细胞抗原表位。这些T细胞抗原表位与辅助T细胞CD4相互作用,大大促进了抗体对多糖的反应。即使对婴儿,多糖结合疫苗引起的T细胞依赖性反应都会产生血清免疫球蛋白G(IgG)和记忆B细胞。相比于自然多糖,多糖结合疫苗的免疫原性不依赖于结合多糖的分子大小,结合多糖或寡聚糖表现为相同的免疫原性。A型多糖结合疫苗对于高免疫原性所需要的分子量要求还未清楚论证。

A型多糖结合疫苗在非洲的发展

来自受影响的西非国家的公共卫生官员表示当前需要时间去降低结合疫苗的成本(在美国,0.5美元/剂)。但对于该价格,没有制药公司有兴趣发展单价A型结合疫苗用于撒哈拉沙漠以南地区。

脑膜炎疫苗项目(MVP)成立于2001年,旨在与发展中国家的制药公司合作利用A型多糖结合疫苗在非洲消灭流行性脑膜炎这一公共卫生问题(印度血清研究所有限公司[SIIL],浦那)。脑膜炎疫苗项目工作人员选取了荷兰Synco生物公司的疫苗水平的A型多糖,SIIL来源的类毒素,和法国Aérial的热稳定配方;并选取了美国食品药品监督管理局生物制品评价研究中心细菌多糖实验室发明的高效结合技术。在2004年到2006年,技术转让成功的实现了实验室及中试水平。在2009年之前,脑膜炎疫苗项目的目标是每年生产2500万剂疫苗,到2012年,增加到多于5000万剂疫苗。在SIIL,多糖的生产、纯化、结合过程实现了放大,最终在新厂区实现了工业化生产。同时,在申报临床材料前对于原材料、结合物、产品的分析评价方法进行了制定与充分验证。最终论证认为在生产的全过程,材料稳定。

对于规模的放大,尤其是产品质量的稳定,经过了充分论证。分析SIIL两年的产品数据,显示全过程产率、游离多糖水平、蛋白多糖比非常令人满意,标志从实验室水平的工艺放大的成功。因此该技术从实验室规模到中试规模再到生产规模成功完成。

A型多糖结合疫苗生产与质量控制

多糖化学连接蛋白时,多糖需要活化即化学修饰。当前主要的两种多糖活化方法是高碘酸盐氧化和氰基化作用。高碘酸钠氧化二元醇(两个相邻的碳带有羟基)成为醛(C=O),同时断裂C-C键,使多糖糖环打开。对A型多糖而言,只有缺乏O-乙酰基的重复的3号碳可以被高碘酸钠氧化,这样可以起到保护A型多糖结合疫苗。O-乙酰基占纯化A型多糖的77%-85%,可以起到保护免疫原性的作用。

对于大部分结合产物,在氰基硼氢化钠存在下,活化的多糖的醛基会和蛋白的氨基结合形成稳定的仲胺。多糖醛基与赖氨酸 ε-氨基的结合是一个缓慢的过程,经常仅能获得较低的产率。新的方法被发明出来降低结合时间,提高结合产率。结合效率通过同时活化多糖和蛋白载体蛋白方法提高活化的A型多糖与破伤风类毒素(TT)或酰肼活化的破伤风类毒素(TT-H)在室温条件下反应过夜(15-16小时)。相比于TT,多糖与TT-H结合可以获得更高分子量的结合物。

A型多糖-破伤风结合疫苗被分装成1-2mg、25mg、500mg规格,用于验证结合方法的重复性和可测量性。如图1,在酸性条件下,1-乙基-3(二甲氨基丙基)碳二亚胺条件下,TT的羧基被酰肼替代。A型多糖在无O-乙酰基的多糖处C3-C4被高碘酸钠部分氧化(图1)。TT活度显示每个TT分子50个酰肼基团,而活化的A型多糖100个重复单位/每醛基。使用高效凝胶过滤色谱分离,206nm波长检测未活化、活化后的TT和多糖及多糖-TT结合物。显示活化后的TT分子量大小与未活化前相当,保留时间在22 min,表明较少聚合产生(图2)。活化后的多糖分子量变小,显示部分降解。结合反应之后一个高分子量的峰出现,表明A型多糖-TT结合物产生(图2)。使用TT-H相较于TT,会产生较多结合产物。理化分析在生产过程中的各个环节进行,并存在多种可选方案。Silveira等在研究使用TT-H法生产的C型脑膜炎多糖结合物时,使用核磁共振显示在结合后,活化多糖醛基的消失。同时,也描述了用于表征脑膜炎球菌多糖结合物的物化方法,其中包括肼含量的测定。由于多糖上的多元醛结构和TT上多元酰肼结构,结合方法会产生高分子量的交联结构。该方法还被用于C、W型多糖的结合,可实现50%的结合物产率。

(图1) (图2)

动物体A型多糖结合物免疫研究

A型多糖-TT结合物通过S-400分子排阻色谱分离高分子量和低分子量的结合物。通过S-400分离柱,将结合物分离成4部分(16-20,21-25,26-30,31-35)去研究它们对小鼠的免疫原性。在注射小鼠3&times;1-μg多糖时,相较于游离多糖(≥<100units/mL),无论分子量的大小,所有成份都能引起高水平的抗A型多糖抗体(≥100000units/mL)(图3A)。在兔子体内测试4种分子量的血清杀菌抗体效价发现高于多糖空白对照(<160)(图3B)。人体实验中,血清杀菌抗体效价测试显示相同的趋势,并具有更高的效价(图3B)。这可能是因为两个实验室所使用的菌株不一样,步骤或其他实验原因引起的。在3&times;0.1-μg多糖剂量时,抗体水平随结合物分子量减小而降低(图3A),这可能是因为小分子量的纯化样中结合多糖含量较低(31-35峰)。血清杀菌抗体效价也受结合物分子量大小的影响(图3B)。

为检测结合物的质量和效能,研究了MA031221J在低剂量条件(0.1-μg多糖剂量)下的免疫原性和添加100%-400%多糖或TT的影响(图4)。第一次注射2周后,天然多糖和0.1-μg的多糖结合物仅引起较少的抗体(≤200units/mL),而1-μg可以产生显著的抗体水平(≥1000-3000units/mL)。在第二次或第三次接种后,天然多糖可表现免疫原性(≤1000units/mL),而0.1-μg和1-μg结合物可引起较高水平抗体(≥220000units/mL)。多糖或TT的存在(100%-400%)对0.1-μg和1-μg结合物剂量有较小影响。

在I期人体临床实验前,多种GMP标准下,不同生产规模的A型多糖结合疫苗在小鼠或兔子进行安全性和免疫原性研究。

(图3) (图4)

A型多糖-TT结合疫苗

A型多糖-TT结合疫苗冻干保存,使用前溶解,肌肉注射。疫苗溶解于包含0.01%硫柳汞和0.3 mg三价铝离子(以磷酸铝记)盐溶液中,0.5-mL/剂,包含10μg A型多糖结合10-33μg TT,0.06 mg Trs。最近在免疫扩张项目,5-μg规格的疫苗被WHO提前授权用于婴幼儿免疫。

参考来源:

Frasch CE, Kapre SV, Lee CH, Préaud JM.Technical Development of a New Meningococcal Conjugate Vaccine.Clin Infect Dis. 2015 Nov 15;61 Suppl 5:S404-9.